本研究开发了一种在线毛细管等电聚焦-电喷雾电离接口，通过去除两性电解质提高质谱检验测试灵敏度和稳定能力，同时保持高分辨率分离能力，为蛋白质组学研究提供新工具。
质谱是表征proteoforms的关键技术方法，能为理解生物过程和疾病机制提供重要信息。然而，完整蛋白质的质谱分析需要高分辨率的分离技术来提高检测的灵敏度和特异性。传统的分离方法虽然被大范围的应用，如液相色谱和SDS-PAGE，但其在分离具有相似化学组成或电荷异构体的蛋白质时存在一些局限。毛细管区带电泳（
CZE）虽然能快速分离蛋白质，但低体积加载容量和对大分子电荷异构体的分辨率不足限制了其应用。相比之下，毛细管等电聚焦（cIEF）作为一种高分辨率的分离技术，能够基于蛋白质的等电点（pI）实现高达0.005 pI单位的分离，是研究蛋白质电荷异质性的理想选择。有必要注意一下的是，cIEF在与质谱联用时，两性电解质的存在会严重抑制质谱离子化并污染仪器，导致灵敏度和稳定能力下降。尽管已有多种方法尝试解决这一问题，如降低两性电解质浓度或使用鞘流稀释，但这一些方法通常会以牺牲分离能力和灵敏度为代价。因此，本研究提出了一种在线cIEF-ESI接口，通过在电喷雾电离前去除两性电解质，以提高质谱检测的灵敏度和稳定能力，同时保持cIEF的高分辨率分离能力，从而为蛋白质组学研究提供一种更高效、灵敏的分析工具。cIEF-ESI接口的示意图如图1所示，通过Nafion膜将LPA涂层毛细管和未涂层毛细管连接，形成一个在线接口。Nafion膜是一种高氟聚合物，能够与溶液中的离子发生交换并允许它们透过膜。由于氨基酸两性电解质的分子量较小且具有两性特性，它们能快速通过Nafion膜，并在反向流动的5%异丙醇溶液中被有效去除。作者首先评估了cIEF-ESI接口的分析性能，将氨基酸两性电解质分别在有无5%异丙醇逆流的情况做聚焦（图2A和图2B）。实验结果为在加入5%异丙醇逆流后，氨基酸的信号强度明显降低（减少了267%），这表明Nafion接口能够有效去除两性电解质，同时不影响pH梯度的形成。
图2. cIEF-Nafion-MS分子中，5%异丙醇逆流对氨基酸两性电解质去除的影响。（A）无5%异丙醇逆流；（B）有5%异丙醇逆流。
接着，作者用肌红蛋白测试了不同浓度的氨基酸两性电解质对分离效果的影响（2、4和8mg/mL）。与没有逆流相比，加入5%异丙醇逆流可以明显提高蛋白提取峰的曲线mg/mL的氨基酸两性电解质时，质谱信号的灵敏度最高，信号强度增加了90%以上。但当两性电解质浓度增加到8mg/mL时，信号强度反而下降，这可能是由于过高的两性电解质浓度导致了更多的信号抑制。图3B也表明缺乏两性电解质的去除会导致蛋白信号受到抑制和绝对浓度降低等问题，而加入5%异丙醇逆流可以轻松又有效提高蛋白的响应，强度增加了约10倍。重复性实验也都显示出了肌红蛋白具有相当一致的测量结果和迁移时间，表明该方法拥有非常良好的重现性。随后，作者用更复杂的蛋白混合物体系（细胞色素 C，pI为10.3；肌红蛋白的两种proteoforms，pI分别为7.1和6.8；α-酪蛋白，pI为4.6）检验了该方法的分离情况（图4）。肌红蛋白和α-酪蛋白得到了很好地分离和表征，它们的pI迁移曲线，整体的电流变化也与预期相符。这表明pH梯度在毛细管内成功建立，并在通过Nafion膜迁移到质谱的过程中能够被有效保持。但也必须要格外注意的是，与市售载体两性电解质相比，作者也提到氨基酸两性电解质在分辨率和分离度上存在一些固有局限，特别是对于高pH梯度范围。因此，pI较大的细胞色素C在这五种氨基酸组成的两性电解质中的分离效果欠佳，要想得到更为细致的分离，还要进一步细化氨基酸浓度和组成。
图3.（A）不同浓度氨基酸两性电解质对于Nafion渗透的影响（2、4和8mg/mL），黑色和灰色分别表示有无5%异丙醇逆流；（B）肌红蛋白在氨基酸两性电解质浓度为2mg/mL时的质谱图。
图4.（A）肌红蛋白和α-酪蛋白的提取离子流谱图；（B）cIEF整体电流变化；（C）肌红蛋白和α-酪蛋白的pI迁移曲线。
最后，作者也用BSA的酶切产物检验了该方法在肽段水平的分离情况。由于肽段的分子较小，性质相对明确，所以具有更精确的pI。这里选择了八条pI差异较小的肽段来评估该方法的分辨能力（pI范围：3.93~4.56）。如图5A所示，它们的峰型比较尖锐，平均峰宽为7.1s，每条肽段都能做到基线 pI的分离。这八条肽段的pI迁移曲线也具有较高的相关系数，R2为0.88（图5B）。但实验也发现中性和碱性的肽段会在较短时间内完成迁移（图5C），该现象在此前文献中也被报道。尽管Nafion膜对于氨基酸两性电解质的去除不可能影响pH梯度的分辨率和蛋白的分离，但这也表明氨基酸作为两性电解质时的pH梯度是非线性的，尤其是在高pH梯度时不会产生连续的pH梯度。因此，未来还需要更加多的工作来改善该方法在中性和碱性pH环境下的非线.（A~B）八条酸性BSA酶切肽段的分离情况和pI迁移曲线；（C）宽pH范围的BSA酶切肽段的pI迁移曲线。
总的来说，本研究开发并验证了一种在线cIEF-ESI-MS接口。通过有效去除氨基酸两性电解质，它明显提高了质谱检测的灵敏度和稳定能力，同时保持了cIEF的高分辨率的分离能力。这为蛋白质和肽段的分析提供了一种新的工具，有望推动蛋白质分离的发现和开发进程。
文章引用：Capillary Isoelectric Focusing of Proteins and Peptides Using an In-Line cIEF-ESI Interface with Improved MS Characteristics.通讯作者是美国圣母大学的Matthew M. Champion。